RNA实验和方案新手必读（四）

在检测RNA样本时，需确保比色杯中去除了RNA酶，特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些RNA的情况下。该条件可通过使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释RNA的缓冲液为分光光度计设定空白对照。

在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度计中，测量260 nm的吸光值(A260)以确定RNA的浓度。为了确保获得有意义的结果，读值应在0.15与1.0之间。在260 nm波长下，1个单位的吸光值对应每毫升44 µg的RNA浓度（A260=1 → 44 µg/ml；基于标准的1 cm测光距离）。这一相关性仅对中性pH值条件下的检测有效。因此，如需稀释RNA样品，则应使用中性pH值的低盐缓冲液（例如10 mM Tris•Cl ，pH7.0）。

在检测RNA样本时，需确保比色杯中去除了RNA酶，特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些RNA的情况下。这可以通过使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释RNA的缓冲液为分光光度计设定空白对照。列举一个RNA定量中的计算实例如下：

RNA定量举例
RNA样品的体积= 100 µl
稀释=10 µl RNA样品+490µl 10 mM Tris•Cl ，pH 7.0（1/50的稀释比）
使用1 ml（已去除RNA酶）比色杯，检测稀释后样本的吸光度
A260 = 0.2

RNA浓度
= 44 µg/ml x A260 x稀释系数
= 44 µg/ml x 0.2 x 50 
= 440 µg/ml

RNA总量 
=浓度x以毫升为单位的样品体积
= 440 µg/ml x 0.1 ml 
= 44 µg RNA

RNA纯度

在260 nm与280 nm读值之间的比例（A260/A280）能够反映RNA的纯度，因为如蛋白一类的污染物会吸收紫外光。不过，A260/A280的比值也受到pH值的显著影响。当使用没有缓冲能力的水时，pH值与A260/A280的比值结果都会发生大范围的改变。 较低的pH值会导致A260/A280的比值变小，对蛋白质污染的敏感性也会随之降低（3）。

为了获得的比率，我们建议在微碱的低盐缓冲液中检测吸光度（例如10 mM Tris•Cl，pH7.5）。在10 mM Tris•Cl，pH 7.5缓冲液当中，纯RNA的A260/A280 比率约为1.9–2.1。

注：某些分光光度计在检测纯RNA时，可常规获得高达2.3的比值。

请确保使用同种溶液校准分光光度计。不过，为了准确确定RNA的浓度，我们仍建议使用中性缓冲液稀释RNA样本，因为吸光度和浓度（A260读值为1相当于44 µg/ml的RNA浓度）之间的关系是一个基于中性条件获得的吸光系数。

RNA的完整度

总RNA的完整度和大小分布可以通过变性的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色或市售的检测系统（如QIAxcel系统或Agilent 2100 ）进行检测。每条核糖体RNA的富集区域在凝胶染色之后应显现为锐利的条带。28S核糖体RNA的条带亮度应为18S rRNA条带的两倍左右。如果某一泳道中核糖体RNA条带不够锐利，却出现小尺寸RNA的弥散情况，则很可能因为RNA样品在制备过程中发生了严重的降解。

Agilent 2100 Bioanalyzer也能够RNA完整数目（RNA Integrity Number，RIN）这一参数，作为对RNA完整度的一个有用量度。在理想情况下RIN值应接近10，不过在许多情况下（特别是对组织样本来说），RNA品质主要取决于原始样本的保存情况。

不同来源的核糖体RNA大小

变性凝胶分析的原理

利用RNA在甲醛琼脂糖凝胶中的电荷迁移效应，可对RNA进行分离和鉴定。RNA不像DNA，它们具有复杂的二级结构，因此需使用变性凝胶。凝胶中的甲醛能够破坏RNA的二级结构，从而使得RNA分子严格按照电荷迁移的方式得到有效分离。

在电场中，主链磷酸基团上所携带的负电荷使核酸分子向阳极移动。变性的RNA分子的迁移速率取决于它们的尺寸大小；不过片段大小与迁移速率之间并非线性相关，因为更大的片段会遇到更大的摩擦阻力，在凝胶中移动更为困难。

琼脂糖凝胶分析是为常用的RNA分析方法，通常依据RNA的大小相应选择合适分辨范围的琼脂糖凝胶。小的RNA片段，如tRNA或5S rRNA，可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。可查阅分子生物学手册（2,4）以获得关于各类分析胶的详细信息。本节将针对甲醛琼脂糖凝胶电泳进行介绍。

制备用于RNA分析的甲醛琼脂糖凝胶

下列甲醛琼脂糖（FA）凝胶电泳方案能够提高凝胶分离及后续检测（例如RNA印迹）的灵敏度。本方案的关键特点在于使用了浓缩的RNA上样缓冲液，从而（相比传统实验方案）能够向凝胶中载入更大量的RNA样本。

琼脂糖

用于制备凝胶的琼脂糖是针对所分离RNA片段的大小来确定浓度范围的。对于大多数的目的RNA种类来说，使用1.0–1.2%（质量体积比）的琼脂糖浓度可获得佳结果。对于较大的mRNA种类，降低琼脂糖浓度可能会有所帮助。如需分离更小的mRNA，琼脂糖浓度可提高至2%。对于较小的RNA种类，如tRNA或rRNA，则推荐使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

请使用超纯琼脂糖，因为如多糖类、盐类和蛋白一类的杂质都会对RNA的迁移造成影响。

小贴士：某些电泳槽的塑料不耐乙醇。请对此适当留意，并核对厂商的说明书。

Total RNA-甲醛琼脂糖凝胶

每个泳道10ug RNA