RNA提取纯化的注意事项

由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。

1. RNases 是非常稳定和活跃的一种酶，一般不需要辅助因子的功能，因而在实验室内 RNA 很容易被降解
2. 如果不预先消除可能的 RNase 污染，请不要使用任何塑料制品或玻璃制品
3. 纯化的 RNA 溶解在 RNases-free 的水中，在 –20℃或 –70℃进行储存长达一年不会引起 RNA降解

    对于使用 RNeasy Kit 进行 RNA 纯化，一般不要求额外的 DNase 消化过程，这是因为 QIAGEN的 RNeasy 硅胶膜技术能够高效去除大部分的 DNA。然而，对于某些基于 RNA 的敏感应用，我们建议同时使用 RNase-free DNase Set（操作流程可以参见 RNeasy 产品说明书）对 DNA 进行消化，确保得到的 RNA 无任何 DNA 的污染。

     RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。除了操作时需要注意RNA酶，那么针对不同类型的样本，进行RNA纯化时有哪些需要注意的地方呢？

从富含纤维的组织中分离 RNA（如心脏或肌肉组织等）有一定难度，这是因为纤维组织中的收缩蛋白，结缔组织，胶原等成分都会干扰 RNA 的纯化过程。所以为了去除这些蛋白的影响，组织样本需要用含有蛋白酶或含酚的裂解液。同时上述处理条件不能引起 RNA 降解，QIAGEN 推荐使用 RNase-free proteinase K 进行消化。

固定和包埋的过程能导致核酸的严重降解和化学修饰，通常我们从 FFPE 样本中纯化得到的核酸的分子量要小于新鲜或冰冻组织。核酸降解/片段化的程度依赖于样本类型和年龄，另外和固定，包埋和储存条件也有很大关系。

请依照以下建议进行 FFPE 样本的处理，以减少对 RNA 的损伤

• 尽快取出组织样本并进行固定
• 组织样本的厚度不要超过 5 mm，固定时间不要超过 24 小时
• 使用高质量试剂进行石蜡包埋，不要使用添加剂
• 如果可能的话，避免对样本进行染色
• 储存 FFPE 样本的条件要合适，如在 4 度进行存放长达 1 年，仍可纯化到高品质 RNA
• 使用合适的脱蜡溶液进行脱蜡处理
• 在 RNA 纯化过程要有逆转交联的步骤，便于大程度释放 RNA 分子
• 去除基因组 DNA 的污染

全血中红细胞没有细胞核，每毫升血液中实用细胞数少，核酸得率比较低，所以从全血中分离的目标是白细胞。此外，还必须除去污染物如抗凝剂肝素和 EDTA 以及天然存在的酶抑制剂，这些物质都会干扰下游的 RNA 分析。QIAamp RNA Blood Kits 高度适合从人血液样本中纯化高品质RNA，能消除 RNases，污染物和酶抑制剂，同时大程度去除基因组 DNA 的污染。

RNA 尤其是 miRNA 可在血清，血浆，尿液和其他体液中存在，并且也存在于细胞培养液的上清液中。胞外 RNA 的含量比胞内 RNA 要低的多，但是它相对稳定，在人全血中的半衰期约为 2天。然而，多次反复冻融仍然会导致纯化效果变差。推荐纯化过程中使用 carrier RNA 来提高游离 RNA 的回收效率。

一些病毒具有单链或双链 RNA 基因组。病毒 RNA 通常是分离自无细胞体液中，而这些样本中病毒核酸的含量非常低。 病毒颗粒可能需要通过超速离心，超滤或沉淀的方式进行浓缩。推荐纯化过程中使用 carrier RNA 来提高游病毒 RNA 的回收效率。另外推荐使用合适的逆转录酶对某些含有复杂二级结构的病毒核酸进行逆转录。